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ELISA實驗中常見出現問題及解決辦法

提供者:上海elisa生物技術有限公司   發布時間:2019/7/30  閱讀次數:165次   進入該公司展台

  ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。除了盒子本身質量外,操作中很多因素都影響試驗的正常結果。最常出現的問題是顯色淡,靈敏度偏低、重複性不佳、假陽性結果和假陰性結果,不管出現什麽樣的結果,不但浪費客戶的金錢、樣本、精力,更重要的是對臨床做出了危險判斷。在這裏我們分析ELISA試驗非正常檢測結果産生的常見原因,並探討其解決辦法,以提高檢測質量。
 
   一、顯色淡,靈敏度偏低
 
    1.試劑盒在運輸途中時間太長,溫度太高;所以盡量縮短運輸時間,夏季應放冰塊降溫。
 
    2.試劑盒未充分平衡;所以試劑盒從2~8℃冰箱取出後打開盒蓋,于室溫平衡至少20分鍾,確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)。
 
    3.培養箱溫度不足37℃,應注意培養箱溫度,放入反應板後盡量減少開啓次數以免影響溫度恒定,非隔水式培養箱尤其應注意。
 
    4.保溫時間不足;所以做實驗時一定注意時間的重要性,如果怕忘了時間,可以校正定時鍾准確定時。
 
    5.洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數增加;按說明書要求保留洗滌時間,准確記住洗滌次數。
 
    6.移液器吸液量不足,吸嘴內壁挂水太多或內壁不清潔;所以保證校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密,吸嘴內壁要清潔,最好一次性使用。
 
    7.蒸餾水水質有問題,要使用新鮮合格的蒸餾水。
 
    二、重複性較差,經常有客戶反饋說做了兩個複孔值相差太大。可能的問題有:
 
    1.樣品數量多少不一,加樣時間有長有短;所以重複某一樣品時,加樣時間盡可能接近。
 
    2.保溫時間不一致,洗滌條件不一致,操作人員不一致;重複測定標本,操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性。
 
    3.加樣量不一致;樣品稀釋前應充分混勻,盡可能使用同一移液器並裝緊吸嘴。
 
    三、假陽性結果和假陰性結果
 
    1.標本的采集與保存
 
    1.1當標本采集保存不當産生溶血時,紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中,血紅蛋白具有過氧化物酶的性質,其通過吸附或“PP效應”(蛋白質間相互吸附的現象)結合後,可催化A、B液顯色而造成假陽性
 
    1.2標本采集保存不當致細菌汙染,菌體中可能含有內源性HRP,會産生假陽性反應;標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG聚合,易使間接法的試驗本底加深。因此,標本宜在新鮮時檢測。
 
    1.3反複凍融血清會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測,宜少量分裝凍存。
 
    2.加樣
 
    2.1  如果 樣品稀釋液少加或血清多加,都會引起本底增高。對于間接法來說,受上述兩個因素影響更大。因爲血清中受檢的特異性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強,非特異性IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標二抗發生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多,高于規定的稀釋倍數,極易造成高值陰性。反之,造成假陰性。
 
    2.2   如果加入的酶結合物過多或加在較高的孔壁上或孔口,也會引起本底升高或假陽性。
 
    2.3  如果血液未開始凝固或凝固不完全時就強行離心分離血清,此時的血清中仍留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結果。
 
    3.溫育
 
    3.1 由于ELISA試驗在一定溫度下的反應時間並不是反應的終點,溫育時間過短、溫度過低,易致顯色不全;溫育時間過長、溫度過高,易致非特異性結合緊附于反應孔周圍,難以清洗徹底,産生陰性高值或假陽性反應。因此,要嚴格按規定的溫度和溫育時間進行。
 
    3.2 由于水浴較難將溫度控制在穩定的範圍,因此我們每次試驗時應認真觀察水浴箱的溫度,盡量少開啓水浴箱門,嚴格控制水浴的溫度爲37±0.5。同時,微孔板不可重疊放置,以保證傳熱均勻,各板的溫度都能迅速達到平衡。
 
    3.3 由于試劑盒通常設定的反應溫度爲37度,在這個溫度下溫育一定時間,蒸發的水分會很多,對于整個反應體系來講,各種反應物的濃度會不斷地增加,這樣必會導致反應最後的值升高。因此溫育時應貼上封板膠。
 
    4.洗板
 
    洗板在ELISA過程中雖不是一個反應步驟,但卻是決定試驗成敗的關鍵。ELISA就是靠洗板來達到分離遊離的和結合的酶標記物的目的,通過洗板以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的幹擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗板時應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。在ELISA操作中,洗滌是最主要的關鍵技術,應嚴格按要求洗滌。洗板如不徹底,有酶結合物的非特異性吸附,將使空白值升高。另外,在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗淨,也將與酶標記抗體作用而産生幹擾。
 
    4.1 各廠家的洗液是根據各自試劑的條件配制的,因此采用不配套的洗液常會得到不正常的反應結果,包括本底升高,所以不同廠家的洗液不應混用。
 
    4.2 洗液應按規定的倍數稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的,過多稀釋洗液,會影響洗液的效果,而使反應的本底升高。反之造成假陰性。
 
    4.3 稀釋洗液的水應該是新鮮的蒸餾水,電導率小于1.5us/cm。如果水中含有過多的鈣、鎂離子,這些離子會占用表面活性劑,使試驗本底增高。
 
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